بیان ژن FSH انسانی در سلول تخمدان همستر چینی و بررسی فعالیت آن در مدل حیوانی رت

نویسندگان

1 گروه میکروبیولوژی دانشکده علوم پایه دانشگاه شاهد، تهران، ایران

2 گروه ژنتیک ﭘزشکی و زیست شناسی مولکولی دانشگاه علوم ﭘزشکی ایران، تهران، ایران

3 گروه داروسازی دانشگاه شهید بهشتی،تهران، ایران

4 گروه زیست شناسی میکروبیولوژی دانشگاه شاهد، تهران، ایران

چکیده

مقدمه و هدف: FSH هورمون گلیکوپروتئین هترودایمری است که در رشد و بلوغ اندام‌های جنسی و صفات ثانویه مؤثر است. گنادوتروپین‌های قابل تزریق نقش پیشرو در درمان ناباروری داشته‌اند. تولید FSH در داخل کشور یکی از اهداف مهم پیرامون این دارو است. هدف از این مطالعه امکان تولید آزمایشگاهی FSH نوترکیب می‌باشد.
 
مواد و روش­ها: وکتور حاوی زیر واحد آلفا و بتای ژن FSH انسانی در باکتری DH5α  انتقال و پلاسمید جداسازی و توسط لیپوفکتامین 2000  به سلول تخمدان همستر چینی ترانسفکت شد. سلول‌ها بوسیله نئومایسین به مدت 10 روز تیمار و سلول‎های ترانسفکت شده انتخاب شدند. بیان پروتئین بوسیله الایزا مورد بررسی قرار گرفت. محصول با روش کروماتوگرافی افینیتی خالص شد. جهت محاسبه راندمان تخلیص، غلظت پروتئین قبل و بعد از کروماتوگرافی به وسیله الایزا مورد سنجش قرار گرفت. جهت تائید خلوص پروتئین از روش SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ استفاده شد. سپس به رت ماده تزریق و عملکرد پروتئین بررسی شد.
 
نتایج: بیان پروتئین با استفاده از تست الایزا در 450 نانومتر mIU/ml 538/43 تائید شد. در مرحله تخلیص با روش کروماتوگرافی افینیتی، پیک مربوط به FSH در بازه زمانی حدود 9/7 دقیقه مشاهده و راندمان تخلیص 70% محاسبه شد. وجود باند 45 کیلودالتونی بر روی ژل و غشای PVDF پس از تخلیص، حضورFSH  را تائید نمود. افزایش وزن  تخمدان بعد از تزریق، عملکردی بودن پروتئین را تائید نمود.
 
نتیجه‌گیری: در حال حاضر تولید هورمون‌های نوترکیب از نیازهای کشور محسوب می‌شود، بنابراین دست‌یابی به این هدف ارزشمند نیاز به برنامه‌ریزی بلندمدت دارد و ما در این پژوهش سعی نمودیم این مسیر را به منظور تولید هورمون FSH انسانی به‌ عنوان یک داروی نوترکیب مؤثر در درمان ناباروری هموار نماییم.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Expression of human FSH in Chinese hamster ovarian cells and its activity in a rat model

نویسندگان [English]

  • Aezam Mousivans 1
  • Shahram Timurian 2
  • Maryam Rezaei 2
  • Amirhassan Shahabi 3
  • Iraj Rasooli 4
چکیده [English]

Background and Objective: FSH is a heterodimeric glycoprotein that performs an important role in the regulation of reproductive processes. Over the past decades, injectable gonadotrophins have played a leading role in the treatment of infertility. The production of FSH in the country is one of the main goals around this drug. The aim of this study was to produce a semi- industrial recombinant FSH.
 
Materials and Methods: In this research study, the FSH gene contained within the pVITRO2-neo-mcs vector was transfected into the cell line of CHO after transformation in DH5α and plasmid purification. The amount of FSH in cell supernatant was measured by ELISA. The FSH protein was purified by HPLC. The presence of FSH protein after purification was confirmed by SDS-PAGE and Western blotting methods. Finally, the clinical effects of purified FSH on the ovary in the rat model were investigated.
 
Results: The expression of the protein was determined by ELISA test at 450 nm that was 43.538 mIU/ml. In the HPLC purification step, the FSH peak was observed at a time interval of about 7.9 minutes, and the purification efficiency was 70%. The existence of a 45 KDa band on the pvdf membrane was confirmed after western blotting of FSH.  Increasing the weight of the ovary after the injection has confirmed the functionality of the protein.
 
Conclusion: At present, the production of recombinant hormone is one of the basic needs of every country. In order to arrive at this aim, a long-term planning is required. We are trying to pave the way for producing human FSH hormone as an effective recombinant drug in the treatment of infertility.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • E. coli
  • Follicle stimulating hormone (FSH)
  • Expression
  • Chinese hamster ovary cell line (CHO)

مراجع

1. Direkvand-Moghaddam A, Delpisheh A, Direkvand-Moghaddam A. Effect of infertility on the quality of life, a crosssectional study. Journal of Clinical and Diagnostic Research 2014;8(10): 5-13. 2. Smitz J, Wolfenson C, Chappel S, Ruman J. Follicle-Stimulating Hormone: A Review of Form and Function in the Treatment of Infertility. Reproductive Sciences 2016; 23: 706–716. 3. Strauss JF, Barbieri RL 2013 Yen and Jaffe's Reproductive Endocrinology. Elsevier - Health Sciences Division 4. McKerns KW 2012 Structure and Function of the Gonadotropins. Springer US. 5. Fox, KM, Dias, JA and Van Roey, P. three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Molecular Endocrinology 2001; 15(3): 378–389. 6. Grigorova M. Worldwide variation of follicle-stimulating hormone beta-subunit gene and its potential association with reproductive success. master thesis. Tartu University 2006; 3-62. 7. Ng EH. Lau EY. Yeung WS. Ho PC. HMG is as good as recombinant human FSH in terms of oocyte and embryo quality. Human Reproduction 2001; 16: 319-325. 8. 8 Kim JY, Kim YG, Lee GM. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 2012; 93: 917–930. 9. Omasa T, Onitsuka M, Kim W. Cell Engineering and Cultivation of Chinese Hamster Ovary (CHO) Cells. Current Pharmaceutical Biotechnology 2010; 11: 233-240. 10. Lim JY, Yoon JW, Hovde CJ. A Brief Overview of Escherichia coli O157:H7 and Its Plasmid O157. Journal of Microbiology and Biotechnology 2010; 20(1):5-14. 11. Winstel R, Wieland J, Gertz B, Mueller A, Allgaier H. Manufacturing of Recombinant Human Follicle-Stimulating Hormone Ovaleap (XM17), Comparability with Gonal-f, and Performance/Consistency. Original Research Article 2017; 17(2): 305-312. 12. Rose TH, shammar DR, Erichsen L, Grundemar L, Ottesen JT. Characterisation of Population Pharmacokinetics and Endogenous Follicle-Stimulating Hormone (FSH) Levels After Multiple Dosing of a Recombinant Human FSH (FE 999049) in Healthy Women 2016; 16:165–172. 13. Speroff, L. & Fritz, M. A. (2005) Clinical gynaecologic endocrinology and infertility, lippincott Williams & wilkins. 14. Novak E, Berek JS. Berek and Novak's gynecology, Lippincott Williams and Wilkins 2007; 297(14): 1601-1604. 15. Matzuk MM, Burns KH, Viveiros MM, Eppig JJ. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science 2002; 296(5576): 2178-2180. 16. Christie A. Kelton, Shirley V.Y. Cheng, Noreen P. Nugent, Rene L. Schweickhardt, Judy L. Rosenthal, Susan A. Overton, Gregory D. Wands, Jennifer B. Kuzeja, Carol A. Luchette and Scott C. Chappel. The cloning of the human follicle stimulating hormone receptor and its expression in COS-7, CHO, and Y-l cells. Molecular and Cellular Endocrinology 1992; 89: 141- 151. 17. C.M.Howles. Genetic engineering of human FSH. Human Reproduction Update 1996; 2 (2): 172-191. 18. Kim JY, Kim YG, Lee GM. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology 2012; 93: 917–930. 19. Wang XN, Greenwald GS.NHypophysectomy of the cyclic mouse. II. Effects of follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone on folliculogenesis, FSH and human chorionic gonadotropin receptors, and steroidogenesis. Biology of Reproduction 1993; 48(3): 595-605. 20. Allan CM. Wang Y. Jimenez M. Marshan B. Spaliviero J. IIIingworth P. et al. Follicle stimulating hormone increases primordial follicle reserve in mature female hypogonadal mice. Endocrinology. 2006; 188: 549-557. 21. Nazari T,Zinolzadeh M,Radman R, Ismaꞌil Zadeh S, Basirat Z, Haji Ahmadi M, Farsi M. Comparison of ovulation induction with recombinant FSH and hMG-HP in fertility cycles 1368; 9(3): 27-32 22. Khalili Mohammad Ali, Agha Rahimi Azam, Mir Esmaeili seyed Mohsen, Comparison of efficiency of human gonadotropins of urine and recombinant type using animal model. Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences 1389; 9(1): 15-26 23. Lehert P, Kolibianakis E, Venetis C, Schertz J, Saunders H, Arriagada P, Copt S, Tarlatzis B. Recombinant human follicle-stimulating hormone (r-hFSH) plus recombinant luteinizing hormone versus r-hFSH alone for ovarian stimulation during assisted reproductive technology: systematic review and meta-analysis. Reproductive Biology and Endocrinology 2014; 12: 17 24. Keel B, May J, Delonge C. Textbook of assisted reproductive technique. CRC Co. 2000; 3-180.
دانشور پزشکی
دوره 26، شماره 6 - شماره پیاپی 139
139
بهمن و اسفند 1397
صفحه 1-8

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار